撰文
Qi
CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat）技术的兴起为现代生物学带来翻天覆地的变化，并为实施治疗性基因修正提供了一种高效的手段。然而，传统的CRISPR技术往往是通过激活DNA双链断裂（double-strandbreak,DSB）修复途径来启动编辑的，这会对细胞产生不良影响，从而限制了该技术的某些治疗应用。为此，现阶段已开发出几种基于CRISPR的新型#基因编辑#模式，允许在非DSB的条件下催化基因编辑。
图源：百度不久前，来自美国伊利诺伊大学的ThomasGaj团队在TrendsinBiotechnology杂志上发表了一篇题为Next-GenerationCRISPRTechnologiesandTheirApplicationsinGeneandCellTherapy的综述，在文章中，作者详细回顾了其中三种新兴技术，分别是baseeditors,primeeditors以及RNA-targetingCRISPR-associatedprotein(Cas)13effectors，通过讨论这三种技术与传统基因修饰系统相比的优势，强调各自的治疗应用，并探讨了安全有效的临床应用将会面临的挑战。
01迫在眉睫：跳脱出DNADSB的新型治疗性基因编辑技术
尽管传统的CRISPR系统已在临床试验中被评估用于安全修正镰状细胞病和β-地中海贫血两种遗传性血液疾病，以及Leber先天性黑蒙10型这种遗传性视网膜疾病的能力，但它们依赖于DNA断裂来刺激基因编辑过程可能会破坏它们的安全性，例如引起包括染色体易位，基因组缺失，适应性降低，细胞周期功能障碍，以及肿瘤抑制蛋白TP53的激活等不良反应。此外，同源重组修复（homology-directedrepair,HDR）是CRISPR核酸酶最常用于将特定变化引入DNA序列的修复途径，在某些细胞类型中通常受到其效率的限制，由于HDR通常只能在分裂细胞中实现修复，这可能阻止其在有丝分裂后细胞中实现治疗性基因校正。需要注意的是，HDR往往会被非同源末端连接（nonhomologousendjoining,NHEJ）的DNA修复方式限制，NHEJ作为一种易出错的DNA修复途径，可在靶位点产生突变性碱基插入和缺失（insertionsanddeletions,indels）。因此，迫切需要发展一门新技术，既要包含CRISPR核酸酶的可编程性和灵活性，也要克服上述基本限制。下面作者将对此集中展开讨论。
02BaseEditors：临床前试验的成功及未来挑战
Baseeditors，包含Cas9-nickase（nCas9）和通过催化靶向脱氨基反应启动碱基编辑的碱基脱氨酶的融合。nCas9作为Cas9核酸酶的一种变体，能够产生单链而非双链DNA断裂。迄今为止，已经开发出几种不同的碱基编辑器用于哺乳动物细胞，包括胞嘧啶碱基编辑器（cytosinebaseeditors,CBEs），它可以催化目标胞嘧啶的脱氨基作用，以促进其转化为胸腺嘧啶；腺苷碱基编辑器（adenosinebaseeditors,ABEs），能使靶腺苷脱氨基，以促进其向鸟苷的转化；以及最近的一种鸟苷碱基编辑器（guanosinebaseeditors,GBEs），能在某些情况下产生CG的转换。为了催化单个碱基的修饰，baseeditors会根据sgRNA的指示，首先结合到一个特定的基因组靶点，在形成使局部靶DNA序列变性的nCas9–sgRNA–DNA三元复合物之后，脱氨酶通常在暴露的DNA链中的核苷酸“窗口”内与其同源碱基结合，随后催化脱氨基反应。与HDR不同的是，这些过程背后的修复机制似乎在分裂细胞和非分裂细胞中都足够活跃，这表明baseeditors可以作为一种更为广泛适用的治疗方式。
图1.CBEs和ABEs两种baseeditors的基因编辑模式图鉴于其相当强大的优势以及为治疗性基因编辑提供新机会的潜力，baseeditors已迅速部署用于治疗许多疾病。举例而言，证明其治疗潜力的首个成功范例是发现ABEs可以输送到骨骼肌，以恢复杜氏肌营养不良（DMD）小鼠模型中肌营养不良蛋白基因（dystrophin）的表达。然而，由于大多数baseeditors蛋白超出单个腺相关病毒（AAV）载体的承载能力，因此需要两个AAV颗粒来传递ABEs，随后通过每个载体中存在的反向末端重复（invertedterminalrepeat,ITR）序列间的重组反应重新连接。此外，作为替代方法，内含肽介导的蛋白质反式剪接，一种利用内肽结构域的自剪接来催化两个单独表达的多肽连接成单个蛋白质链的方法，也被用于将baseeditors的两部分重组成全长蛋白，并且这种方法也已经在苯丙酮尿症小鼠模型中首次被证明具备体内基因校正的潜力。值得注意的是，采用脂质纳米粒（lipidnanoparticles,LNP）的非病毒传递方法已经在HTI小鼠模型中实现基因校正，更为重要的是，LNP传递的mRNA只能短暂维持，因而可以减少病毒载体细胞持续表达baseeditors蛋白而累积脱靶效应的风险。
除了纠正功能缺失突变外，baseeditors还可用于沉默基因表达，例如通过催化CGA、CAG、CAA和TGG三胞胎的靶向CT转换，CBEs可以产生提前终止密码子，通过无义介导的降解（nonsense-mediateddecay,NMD）导致靶标mRNA降解，这是细胞用来防止截短蛋白形成的监督机制，类似地，ABEs可以通过改变ATG起始密码子来阻止基因表达。重要的是，baseeditors可以用来沉默具有毒性功能获得性突变的基因的表达，例如引起目前仍无有效治愈方案的肌萎缩性侧索硬化症的突变基因失效等。此外，也已通过实验证明baseeditors具备增强CAR-T细胞治疗效果以及用于通过修改非编码序列中的功能元件来调节基因表达的能力。
尽管baseeditors的治疗潜力已经在多个研究中得到证实，但该技术的临床应用特别是在安全性和体内疗效方面，仍须克服许多障碍，例如脱靶效应。由于AAV已成为一种非常有前途的治疗性基因传递载体，因此评估“双载体策略”在大型动物模型体内传递baseeditors的有效性，潜在免疫原性和长期安全性，以及确定AAV载体传递的baseeditors以何种频率整合到宿主细胞基因组中也十分重要。
03Primeeditors：一种具有广泛治疗潜力的新型基因编辑技术
尽管baseeditors已经扩大了基因编辑的治疗应用范围，但该技术仍然受到当前脱氨酶结构域功能的部分限制，虽然其能够实现碱基转变，但并不能插入或删除DNA序列。然而，最近报道的一种替代性基因编辑技术称为“primeediting”，有可能克服上述功能限制。
Primeeditors由连接到逆转录酶（RT）结构域的nCas9和经过修饰的sgRNA，即PrimeeditorsguideRNA（pegRNA）组成，它不仅能指定nCas9的靶向位点，且在DNA修复期间充当RT结构域的模板。与baseeditors相比，primeeditors提供了更大的靶向灵活性，因为它们不受编辑窗口的限制，并且有可能产生所有可能的碱基转换和颠换，从而提供了一种纠正各种可能的基因突变的方法。然而，与活性相似的CBEs和ABEs相比，PE3虽然是目前发现的最有效的DNA编辑系统，但据报道其产生indel副产物的比率有所增加。因此，改进primeeditors以降低indel产率将是今后需要优先注意的事项。通过机器学习策略，不仅可以有效地预测Cas9特定的indel模式，还可以用来改进pegRNA设计以实现更为有效的编辑。类似地，未来也需要更多的研究来确保primeeditors的全基因组特异性，以及确保双载体传递系统策略与primeeditors技术的兼容性以保证进一步地临床研究。
图2.Primeeditors的基因编辑模式图04CRISPR-Cas13Effectors：将CRISPR扩展到DNA编辑之外
尽管CRISPR技术通常与DNA编辑相关，但Cas13酶的发现，即通过CRISPRRNA（crRNA）引导分子结合激活的内在RNase活性切割靶RNA，促进了能够靶向RNA的灵活且可编辑工具的创建。
图3.CRISPR-Cas13Effectors的基因编辑模式图从治疗的角度来看，与反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotides,ASOs）和RNAi类似，CRISPR-Cas13Effectors提供了一种抑制基因表达的方式，而不存在诱导细胞DNA损伤的风险，因为已有研究证明Cas13蛋白通常缺乏DNA酶活性。此外，与shRNAs相比，Cas13d蛋白在细胞培养实验中证明存在较少的脱靶效应，这提示它们可能具有更优越的靶向能力（首次证实Cas13d系统在成体动物体内具有靶向沉默RNA的活性）。鉴于这些优势，Cas13蛋白已在体内部署用于测试治疗效果。例如，重复注射旨在靶向可触发癌症的突变KRAS转录本的Cas13RNP可缩小肿瘤异种移植物的质量。由于其紧凑的结构，某些Cas13Effectors，例如RfxCas13可以被包装到单个AAV载体颗粒中以实现体内靶向，通过敲低PTBP1，一种神经元分化的抑制剂，介导视网膜胶质细胞转化为神经节细胞，从而恢复视网膜损伤小鼠模型中的视觉反应（Cell丨利用CasRx在神经性疾病治疗领域取得重大进展）。在帕金森病的小鼠模型中，采用类似的策略诱导大脑中多巴胺能神经元的表达也可以减缓运动功能障碍。值得注意的是，在以上两种情况下，Cas13几乎没有诱导脱靶效应。除了抑制靶mRNA外，Cas13蛋白还可以有效调节选择性剪接，以实现特定外显子的包含或剔除。
然而，Cas13Effectors的临床应用同样可能面临一些障碍，特别是Cas13蛋白必须持续与靶RNA结合以维持其治疗效果。鉴于发现许多个体可能具有针对CRISPR蛋白的预先存在的抗体或反应性T细胞，Cas13蛋白的持续表达可能会对刺激特异性免疫反应构成风险，当然Cas13蛋白的表面可能被重新设计以潜在地规避共同的中和反应。此外，Cas13蛋白可能会带来额外的风险，因为在某些情况下，它们在激活后会切割非靶向RNA。因此，研究Cas13蛋白的免疫原性和靶向特异性对于确定其作为治疗药物的潜力具有重要意义。
05总结与展望
在过去的几年中，能够以高精度和高频率编辑DNA和RNA的技术正在迅猛发展。由于这些技术具有通过修复机制纠正致病突变的能力，因此对于成为一系列疾病的治疗手段而言具有巨大的潜力。但应该注意的是，有必要针对特定的治疗靶点对碱基编辑蛋白进行彻底优化，以确保最大限度地有效形成靶向产物，以及最小化脱靶效应。
除了进一步完善这基因编辑器的功能外，还必须特别注意它们的传输，特别是需要进行大型动物研究，以确定基于AAV的双重载体策略的总体有效性。此外，基因编辑蛋白的任何优化都应与以下优化同时进行：（1）病毒衣壳以确保有效地传递到最相关的细胞群；（2）启动子序列以实现有效且最好是细胞类型特异性编辑。当然，尤为重要的是有效实施新型CRISPR技术还需要广泛评估其免疫原性，虽然DNA编辑技术在理论上具有失活自身表达的能力，但RNA靶向技术必须持续表达才能维持治疗效果，这可能增加其引发免疫反应的风险。因此，对大型动物模型的研究对于帮助确定持续表达Cas13或任何其他新型CRISPR技术是否会导致长期不良反应均具有重要意义。最后，除了上述基因编辑技术外，通过RNA引导的转座机制将大型转基因插入DNA的靶向技术正在积极开发中。总而言之，二代DNA和RNA编辑技术在基因和细胞治疗方面都具有巨大的潜力。
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